Экспрессия GFP гена у эмбрионов и мальков рыбки Danio rerio после микроинъекции генетических конструкций с разными промоторами

В работе рассматриваются проблемы, связанные с получением трансгенных эмбрионов и личинок рыб Daniorerio с экспрессией зеленого флуоресцентного гена (GFP) после введения генетических конструкций с разными промоторами. Несмотря на то, что оптимальной стадией для получения трансгенных организмов является зигота, в пронуклеусах которой активно протекает синтез ДНК, у рыб эмбрионы содержат желток, маскирующий эти пронуклеусы. Вектора вначале попадают в желточную часть эмбриона, что не позволяет чужеродному генетическому материалу попасть в период первого раунда репликации ДНК, поэтому в большинстве случаев у таких видов наблюдается мозаичный тип интеграции и экспрессии трансгена. Как правило, полностью трансгенных рыб получают в результате скрещивания потомства F1 или F2, в половых клетках которых был интегрирован трансген. В наших экспериментах были использованы два типа промоторов: в одном векторе флуоресцентный зеленый белок находился под контролем промотора фактора элонгации человека (плазмидарСЕЕGFP), в другом - под контролем промотора бета актина цыпленка (плазмидарCX-eGFP). Для получения трансгенных эмбрионов и личинок Daniorerio в область бластодиска через 15-20 минут после оплодотворения при помощи микроинъектора проводили микроинъекцию генетических конструкций, содержащих ген GFP. Стадии развития и анализ экспрессии флуоресцентного гена проводили при использовании стереомикроскопа Lumar 12 фирмы Zeiss. Анализу было подвергнуто 372 эмбриона. После введения двух разных генетических конструкций у большинства эмбрионов (от 80 до 88%) экспрессия флуоресцентного гена наблюдается на четвертые сутки развития и только около 30% эмбрионов имеют мозаичный паттерн экспрессии на вторые сутки развития только после микроинъекции рекомбинантной плазмиды рCЕЕGFP. Обращает на себя внимание, что у более 70% эмбрионов экспрессия флуоресцентного гена выявлена в области пищеварительной системы. Начальные этапы экспрессии GFP гена отличались у эмбрионов рыб, полученных после введения разных векторов: самая ранняя экспрессия выявлена на стадии эпиболии (5 часов развития) при использовании конструкции рСЕЕGFP. После ведения вектора pCX-EGFP впервые экспрессии появились на третьи-четвертые сутки развития. Наиболее часто локализация активной зоны флуоресценции располагалась в области пищеварительной системы, а также в отдельных кластерах миоцитов и эпителиальных клеток. Таким образом, начальные этапы экспрессии GFP гена отличались у эмбрионов рыб, полученных после введения разных векторов.

данио рерио, трансгенные животные, плазмиды, репортерные гены, экспрессия генов

1. Козикова Л. В. Трансгенные животные. СПб. Изд-во Проспект науки. 2017. 224 с.

2. Amsterdam A. The Aequorea victoria green fluorescent protein can be used as a reporter in live zebrafish embryos / A. Amsterdam, S. Lin, N. Hopkins // Dev Biol. - 1995. - V.71. - P. 123-129

3. Hrytsenko O. Production of transgenic tilapia homozygous for a humanized insulin gene / O. Hrytsenko, B. Pohajdak, R. James, Jr. Wright // Transgenic Research. - 2010. - V.19. -Issue 2. - P. 305-306

4. Higashijima S. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin / S. Higashijima, H. Okamoto, N. Ueno, Y. Hotta, G. Eguchi // Dev Biol. - 1997. -V.192. - P. 289-99

5. Higashijima S. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer / S. Higashijima, Y. Hotta, H. Okamoto // J. Neurosci. - 2000. - V.20. - P.206-18

6. Long Q. GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene / Q. Long, A. Meng, H. Wang, J. R. Jessen, M. J. Farrell, S. Lin // Development. - 1997. - V.124. - P.4105-11

7. Huang H. Analysis of pancreatic development in living transgenic zebrafish embryos / H. Huang, S. S. Vogel, N. Liu, D. A. Melton, S. Lin // Mol Cell Endocrinol.

8. Her G. M. 435-bp liver regulatory sequence in the liver fatty acid binding protein (L-FABP) gene is sufficient to modulate liver regional expression in transgenic zebrafish. / G. M. Her, Y. H. Yeh, J. L. Wu // Dev Dyn. - 2003. - V.227. - P.347-56

9. Walton E.M. The macrophage-specific promoter mfap4 allows live, long-term analysis of macrophage behavior during mycobacterial infection in zebrafish / E.M. Walton, M. R. Cronan, R. W. Beerman, D. M. Tobin // PLoS One. - 2015. - V.10. - e0138949

10. Krøvel A. V. Expression of a vas:: EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish / A.V. Krøvel, L. C. Olsen // Mech. Dev. - 2002. - V.116. - P.141-50

11. Kozikova L. The viability of Danio rerio embryos and larvae after GFP fluorescent gene microinjection / L. Kozikova, E. Polteva, K. Plemyashov // Reproduction in Domestic Animals. - 2018. - Т. 53. - № S2. - P.153

12. Chou C. Y. Uniform GFP-expression in transgenic medaka (Oryziaslatipes) at the F0 generation / C. Y. Chou, L. S. Horng, H. J. Tsai // Transgenic Res. - 2001. - V.10. - P.303-15

13. Chen Y.H. Multiple upstream modules regulate zebrafish myf5 expression / Y. H. Chen, Y. H. Wang, M.Y. Chang, C. Y. Lin, C. W. Weng, M. Westerfield // BMC Dev Biol. - 2007. - V.7. - P.1

14. Stoletov K. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. / K. Stoletov, R. Klemke // Oncogene. - 2008. - V.27. - P.4509-20

15. Amatruda J. F. Zebrafish as a cancer model system / J. F. Amatruda, J. L. Shepard, H. M. Stern, L. I. Zon // Cancer Cell. - 2002. - V.1. - P.229-31

16. Wang Y. H. A keratin 18 transgenic zebrafish Tg (k18 (2.9): RFP) treated with inorganic arsenite reveals visible over proliferation of epithelial cells / Y. H. Wang, Y. H. Chen, T. N. Wu, Y. J. Lin, H. J. Tsai // ToxicolLett. - 2006. - V.163. - P.191-7

17. Schwarzenbach R. P. Global Water Pollution and Human Health / R. P. Schwarzenbach, T. Egli, T. B. Hofstetter, U. Von Gunten, B. Wehrli // Annu Rev EnvResour. - 2010. - V.35. - P.109-36

18. Garrity D. M. The heartstrings mutation in zebrafish causes heart/fin Tbx5 deficiency syndrome / D. M. Garrity, S. Childs, M. C. Fishman // Development. - 2002. - V.129. - P.4635-45