Эффект IBMX и пролактина на функциональное состояние криоконсервированных сперматозоидов быков

Цель: изучение влияния IBMX (активатора фосфорилирования белков) и пролактина (ПРЛ) на функциональное состояние криоконсервированных сперматозоидов быков путём использования ингибиторного анализа.

Материалы и методы. В экспериментах использовали заморожено-оттаянную сперму 60 быков черно-пёстрой породы. Для проведения капацитации клетки инкубировали в среде Sp-TALP с добавлением 6 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и различных соединений: индуктором капацитации (IBMX в концентрациях 1 мкМ, 10 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ), гормоном (ПРЛ в концентрациях 1 нг, 10 нг, 50 нг, 100 нг) и ингибиторами протеинкиназ С (Ro 31-8220 в концентрации 10 нг/мл) и протеинкиназы А (H-89 в концентрации 10 мкМ). Инкубацию проводили при 38ºС в атмосфере 5% СО₂, 98% влажности в течение 4 часов. Функциональный статус клеток определяли хлортетрациклиновым тестом.

Результаты. Показано, что все используемые концентрации IBMX не оказывали влияния на постэякуляционное созревание (капацитацию и акросомную реакцию) сперматозоидов, тогда как все концентрации ПРЛ (1-100 нг/мл) способствовали прохождению акросомной реакции в капацитированных клетках. В присутствии ингибитора протеинкиназы А отмечали уменьшение процента капацитированных и увеличение доли акросома-реактивных сперматозоидов при действии IBMX в концентрации 100 мкМ и отсутствие изменений при действии ингибитора протеинкиназы С. При ингибировании протеинкиназы С происходила отмена эффекта ПРЛ (в концентрации 10 нг/мл), оказываемого на сперматозоиды, в свою очередь использование Н-89 не влияло на функциональный статус сперматозоидов, опосредованный воздействием ПРЛ.

Заключение. На стадии капацитации все изученные концентрации IBMX не влияли на соотношение деконсервированных клеток с различным функциональным статусом. ПРЛ же способствовал прохождению акросомной реакции в капацитированных сперматозоидах после размораживания. Ингибирование протеинкиназы А при инкубации клеток с IBMX опосредовало протекание процессов акросомального экзоцитоза в капацитированных клетках и не влияло на этот процесс при действии ПРЛ, тогда как ингибитор протеинкиназы С изменял соотношение клеток с различным функциональным статусом в сторону увеличения процента клеток на стадии капацитации при действии ПРЛ и не участвовал во внутриклеточном действии, оказываемом IBMX на деконсервированные клетки.

1. Kumaresan A. Effect of bovine oviductal fluid on motility, tyrosine phosphorylation, and acrosome reaction in cryopreserved bull spermatozoa // A. Kumaresan, A. Johannisson, P. Humblot, A.S. Bergqvist / Theriogenology. 2019. – № 124. – Р. 48-56. doi: 10.1016/j.theriogenology.2018.09.028

2. Jankovičová J. Evaluation of protein phosphorylation in bull sperm during their maturation in the epididymis // J. Jankovičová, K. Michalková, P. Sečová, Ľ. Horovská, P. Maňásková-Postlerová, J. Antalíková / Cell Tissue Res. – 2018. – Vol. 371. – №2. – P. 365-373. doi: 10.1007/s00441-017-2705-x

3. Seita Y. Generation of live rats produced by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa // Y. Seita, S. Sugio, J. Ito, N. Kashiwazaki / Biol. Reprod. – 2009. – Vol.80. – № 3. – P. 503-10. doi: 10.1095/biolreprod.108.072918

4. Águila L. Sperm capacitation pretreatment positively impacts bovine intracytoplasmic sperm injection // L. Águila, F. Zambrano, M.E. Arias, R. Felmer / Mol. Reprod. Dev. – 2017. – Vol. 84. – №7. – P.649-659. doi: 10.1002/mrd.22834

5. Сметанина И. Г. Использование дибутирил-циклического аденозинмонофосфата для капацитации сперматозоидов при получении эмбрионов крупного рогатого скота in vitro // И. Г. Сметанина, Л. В. Татаринов, А. С. Кривохарченко / Известия РАН. Серия Биологическая. – 2019. – №4. – P. 353–357.

6. Itzhakov D. Protein kinase A inhibition induces EPAC-dependent acrosomal exocytosis in human sperm // D. Itzhakov, Y. Nitzan, H. Breitbart / Asian. J. Androl. – 2019. – Vol. 21. – №4. – P. 337-344. doi: 10.4103/aja.aja_99_18

7. Shah G. V. Is prolactin involved in sperm capacitation? // G. V. Shah, A. R. Sheth / Med. Hypotheses. – 1979. – Vol. 5. – № 8. – P. 909-14. doi: 10.1016/0306-9877(79)90079-3

8. Pujianto D. A. Prolactin exerts a prosurvival effect on human spermatozoa via mechanisms that involve the stimulation of Akt phosphorylation and suppression of caspase activation and capacitation / D. A. Pujianto, B. J. Curry, R. J. Aitken // Endocrinology. – 2010. – Vol.151. – № 3. – P. 1269-79. doi: 10.1210/en.2009-0964

9. Денисенко В. Ю. Роль цитоскелета и протеинкиназ А и С в капацитации и акросомной реакции сперматозоидов быков in vitro / В. Ю. Денисенко, Т. И. Кузьмина, Е. Н. Бойцева // Разведение и генетика животных. – 2015. – №4. – С. 46-48.

10. Денисенко В. Ю. Oсвобождение Ca2+ из внутриклеточных депо сперматозоидов Bos taurus в зависимости от их функционального состояния / В. Ю. Денисенко, Т. И. Кузьмина, Е. Н. Бойцева // Цитология. – 2015. – Т. 57. – № 3. – C.233-239.

11. Pons-Rejraji H. Modulation of bovine sperm signalling pathways: correlation between intracellular parameters and sperm capacitation and acrosome exocytosis // H. Pons-Rejraji, J.L. Bailey, P. Leclerc / Reprod. Fertil. Dev. – 2009. – Vol.21. – №4. – P. 511-24. doi: 10.1071/RD07169

12. Fraser L. R. Sperm capacitation and the acrosome reaction // L. R. Fraser / Hum. Reprod. – 1998. – 13. – C. 9-19. doi: 10.1007/978-3-319-30567-7_5

13. Murphy E. M. Effect of increasing equilibration time of diluted bull semen up to 72 h prior to freezing on spermquality parameters and calving rate following artificial insemination // E. M. Murphy / Theriogenology. – 2018. – № 108. – P. 217-222. doi: 10.1016/j.theriogenology.2017.11.034

14. Salmon V. M. Cholesterol-loaded cyclodextrin increases the cholesterol content of goat sperm to improve cold and osmotic resistance and maintain sperm function after cryopreservation // V.M. Salmon, P. Leclerc, J.L. Bailey / Biol Reprod. – 2016. – Vol. 94. – №4. – P. 85. doi: 10.1095/biolreprod.115.128553

15. Fukuda A. Effects of prolactin during preincubation of mouse spermatozoa on fertilizing capacity in vitro // A. Fukuda, C. Mori, H. Hashimoto, Y. Noda, T. Mori, K. Hoshino/ J. In Vitro Fert. Embryo. Transf. – 1989. – Vol. 6. №2. – P. 92-7. doi: 10.1007/BF01138866