Получение культуры соматических клеток с использованием тканевого материала уха погибшего гибрида овцы и снежного барана

Получение и криоконсервация соматических клеток (СК) от ценных и исчезающих животных позволяет сохранить их генетический потенциал, а также обеспечить их репродукцию в будущем.

Цель данной работы состояла в попытке выделить СК из ткани уха погибшего уникального гибрида домашней овцы (Ovis aries) и снежного барана (Ovis nivicola borealis), сравнивая два различных метода обработки ткани: ферментативный и механический.

Материалы и методы. Материал (уши) получен от животного через 12 часов после его гибели на пастбище, доставлен в лабораторию и тщательно промыт от грязи под проточной водой. С части ушной раковины лезвием удаляли волосяной покров, кожу обрабатывали 70 % этиловым спиртом, после чего ткань трижды промывали в физиологическом растворе с антибиотиками и измельчали. Кусочки ткани многократно отмывали в фосфатно-солевом буфере и делили на две части. Одна часть ткани была сразу перенесена в среду культивирования (группа 1: кусочки уха без ферментативной обработки), оставшаяся предварительно подвергалась обработке 0,25 % раствором трипсина/ЭДТА. После трипсинизации использовались либо кусочки ткани (группа 2: кусочки уха с ферментативной обработкой), либо клеточные комплексы, выделенные из суспензионной фракции (группа 3: клеточные комплексы). Контроль формирования и роста культуры проводился ежедневно.

Результаты. В группе 3 с использованием клеточных комплексов, выделенных из кусочков уха в результате трипсинизации, колонии клеток формировались уже на 2 день культивирования. Из кусочков ткани (группа 1 и 2), вне зависимости от способа их обработки, рост клеток начинался через пять дней. На девятый день культивирования от всех групп была получена первичная культура, представленная двумя типов СК. В целом, единичные клеточные комплексы (группа 3) быстрее формировали в культуре зоны роста, но конечные результаты получения культуры СК и их морфологические особенности не отличались от групп 1 и 2, когда кусочки ткани использовались без и после трипсинизации целиком.

Заключение. Таким образом, нами показана возможность выделения культуры СК из ткани уха гибрида овцы и снежного барана, которая была получена через 12 часов после гибели животного.

1. Boettcher P.J. The combined use of embryos and semen for cryogenic conservation of mammalian livestock genetic resources / P.J. Boettcher, A. Stella, F. Pizzi, G. Gandini // Gen. Select. Evol. – 2005. – V. 37(6). – P. 657-675. doi: 10.1186/1297-9686-37-7-657.

2. Pereira R.M. Animal oocyte and embryo cryopreservation / R.M. Pereira, C.C. Marques // Cell and Tissue Bank. – 2008. – V. 9(4). – P. 267-277. doi: 10.1007/s10561-008-9075-2.

3. Malin K. The many problems of somatic cell nuclear transfer in reproductive cloning of mammals / K. Malin, O. Witkowska-Piłaszewicz, K. Papis // Theriogenology. – 2022. – V. 189. – P. 246-254. doi.org/10.1016/j.theriogenology.2022.06.030.

4. Tian X.C. Cloning animals by somatic cell nuclear transfer-biological factors / X.C. Tian, C. Kubota, B. Enright, X. Yang // Reprod. Biol. Endocrinol. – 2003. – V. 13(1). – P. 98-106. doi: 10.1186/1477-7827-1-98.

5. Leon-Quinto T. Developing biological resource banks as a supporting tool for wildlife reproduction and conservation. The Iberian lynx bank as a model for other endangered species / T. Leon-Quinto, M.A. Simon, R. Cadenas, J. Jones et al. // Anim. Reprod. Sci. – 2009. – V. 112. – P. 347-361. doi: 10.1016/j.anireprosci.2008.05.070.

6. Holt W.V. Genome resource banking for wildlife conservation: promises and caveats / W.V. Holt, P. Comizzoli // Cryo Letters. – 2021. – V. 42(6). – P. 309-320.

7. Singina G.N. Cryobanking of somatic cells in conservation of animal genetic resources: prospects and successes / G.N. Singina, N.A. Volkova, V.A. Bagirov, N.A. Zinovieva // Sel'skokhozyaistvennaya Biologiya [Agricultural Biology]. – 2014. – №. 6. – P. 3-14. doi: 10.15389/agrobiology.2014.6.3eng.

8. Keefer C.L. Artificial cloning of domestic animals / C.L. Keefer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2015. – V. 112(29). – P. 8874-8. doi: 10.1073/pnas.1501718112.

9. Skrzyszowska M. Generating Cloned Goats by Somatic Cell Nuclear Transfer-Molecular Determinants and Application to Transgenics and Biomedicine / M. Skrzyszowska, M. Samiec // Int. J. Mol. Sci. – 2021. – V. 22(14). – P. 7490. doi: 10.3390/ijms22147490.

10. Van der Berg J.P. Regulation and safety considerations of somatic cell nuclear transfer-cloned farm animals and their offspring used for food production / J.P. Van der Berg, G.A. Kleter, E.J. Kok // Theriogenology. – 2019. – V. 135. – P. 85-93. doi: 10.1016/j.theriogenology.2019.06.001.

11. Lagutina I. Interspecies somatic cell nuclear transfer: advancements and problems / I. Lagutina., H. Fulka, G. Lazzari, C. Galli // Cell. Reprogram. – 2013. – V. 15(5). – P. 374-84. doi: 10.1089/cell.2013.0036.

12. Selokar N.L. Cloning of breeding buffalo bulls in India: Initiatives & challenges / N.L. Selokar // Indian J. Med. Res. – 2018. – V. 148 – P. 120-124. doi: 10.4103/ijmr.IJMR_2103_17.

13. Leford A. A breed apart / A. Leford // Nature. – 2006. – V. 444(7116). – P. 137. doi: 10.1038/444137a.

14. Woods G.L. A mule cloned from fetal cells by nuclear transfer / G.L. Woods, K.L. White, D.K. Vanderwall et al. // Science. – 2003. – V. 301(5636). – P. 1063. doi: 10.1126/science.1086743.

15. Lanza R.P. Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer / R.P. Lanza, J.B. Cibelli, F. Diaz et al. // Cloning. – 2000. – V. 2(2). – P. 79-90. doi: 10.1089/152045500436104.

16. Folch J. First birth of an animal from an extinct subspecies (Capra pyrenaica pyrenaica) by cloning / J. Folch, M.J. Cocero, P. Chesné et al. // Theriogenology. – 2009. – V. 71(6). – P. 1026-34. doi: 10.1016/j.theriogenology.2008.11.005.

17. Ryder O.A. Viable Cell Culture Banking for Biodiversity Characterization and Conservation / O.A. Ryder, M. Onuma // Annu. Rev. Anim. Biosci. – 2018. – V. 6. – P. 83-98. doi: 10.1146/annurev-animal-030117-014556.

18. Lermen D. Cryobanking of viable biomaterials: implementation of new strategies for conservation purposes / D. Lermen, B. Blömeke, R. Browne et al. // Mol. Ecol. – 2009. – V. 18(6). – P. 1030-3. doi: 10.1111/j.1365-294X.2008.04062.x.

19. Sano M. A Simple Cryopreservation Method for Efficient Isolation of Live Cells from Dead Animals / M. Sano, A. Kawanabe, Y. Kurosawa et al. // Mammal. Study. – 2022. – V. 47(2). – P. 103-111. doi.org/10.3106/ms2021-0019.

20. Niemann H. Somatic cell nuclear transfer cloning: practical applications and current legislation / H. Niemann, A. Lucas-Hahn // Reprod. Dom. Anim. – 2012. – V. 47(5). – P. 2-10. doi: 10.1111/j.1439-0531.2012.02121.x.

21. Cetinkaya G. The value of frozen cartilage tissues without cryoprotection for genetic conservation / G. Cetinkaya, I. Hatipoglu, S. Arat // Cryobiology. – 2014. – V. 68(1). – P. 65-70. doi: 10.1016/j.cryobiol.2013.11.008.

22. Mushahary D. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells / D. Mushahary, A. Spittler, C. Kasper et al. // Cytometry A. – 2018. – V. 93(1). – P. 19-31. doi: 10.1002/cyto.a.23242.

23. Madelaire C.B. Fibroblasts as an experimental model system for the study of comparative physiology / C.B. Madelaire, A.C. Klink, W.J. Israelsen, A.G. Hindle // Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. – 2022. – V. 260. – P. 110735. doi: 10.1016/j.cbpb.2022.110735.

24. Abade Dos Santos F.A. Simple Method for Establishing Primary Leporidae Skin Fibroblast Cultures / F.A. Abade Dos Santos, C.L. Carvalho, I. Almeida et al. // Cells. – 2021. – V. 10(8). – P. 2100. doi: 10.3390/cells10082100.

25. Okonkwo C. Recovery of fibroblast-like cells from refrigerated goat skin up to 41 d of animal death / С. Okonkwo, М. Singh // In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. – 2015. – V. 51(5). – P. 463–4691. doi: 10.1007/s11626-014-9856-9.

26. Singh M. Effect of postmortem time interval on in vitro culture potential of goat skin tissues stored at room temperature / M. Singh, X Ma , A. Sharma // In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. – 2012 – V. 48(8). – P. 478–482. doi: 10.1007/s11626-012-9539-3.

27. Siengdee P. Isolation and culture of primary adult skin fibroblasts from the Asian elephant (Elephas maximus) / P. Siengdee, S. Klinhom, C. Thitaram, K. Nganvongpanit // PeerJ. – 2018. – V. 6. – e4302. doi: 10.7717/peerj.4302.

28. Wang T. Establishment and characterization of a fibroblast cell line from postmortem skin of an adult Chinese muntjac (Muntiacus reevesi) / T. Wang, Z. Li, D. Zheng et al. // In Vitro Cell. Dev. Biol. Animal. – 2020. – V. 56. – P. 97–102. doi.org/10.1007/s11626-019-00422-8.