Разработка системы идентификации аллелей локуса BoLA-BRD3.2 в образцах крупного рогатого скота, содержащих деградированную ДНК

Цель: разработать систему идентификации аллелей локуса BoLA-DRB3.2, направленных на амплификацию коротких целевых фрагментов с последующим секвенированием по Сэнгеру, пригодную для исследования образцов, содержащих поврежденную ДНК.
Материалы и методы. Впервые разработана тест-системы для секвенирования полиморфного участка гена BoLA-DRB3 по Сэнгеру, пригодная для анализа деградированной ДНК. Апробацию системы проводили на 10 современных и 4 древних образцах КРС. Выравнивание последовательностей и типирование аллелей проводилось с помощью программы UGENE v1.32.0 и онлайн ресурса BLAST.
Результаты. Разработана тест-система, позволяющая амплифицировать фрагмент локуса BoLA-DRB3.2, пригодный для дальнейшего анализа посредством секвенирования по Сэнгеру и типирования аллелей. Проанализировано 4 образца ДНК, полученной из древних образцов, предоставленных институтом археологии РАН. В качестве группы сравнения использовались 13 образцов разных пород современных представителей крупного рогатого скота. Для всех исследованных образцов удалось получить последовательности высокополиморфного фрагмента второго экзона локуса BoLA-DRB3.2 длиной 114 п.о., расположенного на BTA23:25 730 221-25 730 334 (сборка ARS-UCD2.0, GenBank: GCF_002263795.3). Однако при прочтении последовательностей части образцов некоторые нуклеотиды были определены неоднозначно. Удалось достаточно уверенно типировать аллели для 10 из 13 образцов: идентичность анализируемых последовательностей с референсными последовательностями аллелей составляла более 99 %. Три современных образца были идентифицированы с меньшим уровнем идентичности (95,536, 96,429 и 98,214 % соответственно для MOD1, MOD9 и MOD8), что может быть связано с неточным прочтением нуклеотида в процессе секвенирования.

1. Mandefro A. Genetic assessment of BoLA-DRB3 polymorphisms by comparing Bangladesh, Ethiopian, and Korean cattle / A. Mandefro, T. Sisay, Z. Edea, M. R. Uzzaman, K. S. Kim, H. Dadi // J. Anim Sci Technol. - 2021. - Vol.2. - P. 248-261. https://doi.org/10.5187/jast.2021.e37.

2. Ilie D. E. Kompetitive Allele Specific PCR Genotyping of 89 SNPs in Romanian Spotted and Romanian Brown Cattle Breeds and Their Association with Clinical Mastitis / D. E. Ilie, D. Gavojdian et al. // Animals. - 2023. - Vol. 9. - P. 1484. https://doi.org/10.3390/ani13091484.

3. Welderufael B. G. Genome-Wide Association Study for Susceptibility to and Recoverability From Mastitis in Danish Holstein Cows / B. G. Welderufael, P. Lovendahl, D. J. de Koning, L. L. G. Janss, W. F. Fikse // Front Genet. - 2018. - P. 141. https://doi.org/10.3389/fgene.2018.00141.

4. Longeri M. Association Between BoLA-DRB3.2 Polymorphism and Bovine Papillomavirus Infection for Bladder Tumor Risk in Podolica Cattle / M. Longeri, Russo V., M. G. Strillacci et al. // Front Vet Sci. - 2021. - Vol. 8. - P. 630089. https://doi.org/10.3389/fvets.2021.630089.

5. Morales J. P. A. Association of BoLA DRB3 gene polymorphisms with BoHV-1 infection and zootechnical traits / J. P. A. Morales, A. Lopez-Herrera, J. E. Zuluaga // Open Vet. J. - 2020. - Vol. 10. - P.331-339. https://doi.org/10.4314/ovj.v10i3.12.

6. Othman O. E. Five BoLA-DRB3 genotypes detected in Egyptian buffalo infected with Foot and Mouth disease virus serotype O / O. E. Othman, M. G. Khodary, A. H. El-Deeb, H. A. Hussein // J. Genet. Eng. Biotechnol. - 2018. - Vol. 2. - P. 513-518. https://doi.org/10.1016/j.jgeb.2018.02.009.

7. LaHuis C. H. Identification of BoLA Alleles Associated with BLV Proviral Load in US Beef Cows / C. H. LaHuis, O. J. Benitez et al. // Pathogens. - 2022. - Vol. 10. - P. 1093. https://doi.org/10.3390/pathogens11101093.

8. Lo C. Bovine major histocompatibility complex (BoLA) heterozygote advantage against the outcome of bovine leukemia virus infection / C. Lo, S. Takeshima, S.Wada, Y. Matsumoto, Y. Aida // HLA. - 2021. - Vol. 2. - P. 132-139. https://doi.org/10.1111/tan.14285.

9. Lo C.-W. BoLA-DRB3 Polymorphism is Associated with Differential Susceptibility to Bovine Leukemia Virus-Induced Lymphoma and Proviral Load / C.-W. Lo, L. Borjigin et al. // Viruses. - 2020. - Vol. 3. - P. 352. https://doi.org/10.3390/v12030352.

10. Xu A. Polymorphism in BoLA-DRB3 exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis caused by bovine leukemia virus / A. Xu, M. J. van Eijk, C. Park, H. A. Lewin // J. Immunol. - 1993. - Vol.12. - P. 6977-6985.

11. Carignano H. A. BOLA-DRB3 gene polymorphisms influence bovine leukaemia virus infection levels in Holstein and Holstein × Jersey crossbreed dairy cattle / H. A. Carignano, M. J. Beribe et al. // Anim Genet. - 2017. - Vol. 4. - P. 420-430. https://doi.org/10.1111/age.12566.

12. Tamura K. MEGA11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 11 / K. Tamura, G. Stecher, S. Kumar // Molecular Biology and Evolution. - 2021. - Vol. 38. - P. 3022-3027.

13. Rose R. Flexible design of multiple metagenomics classification pipelines with UGENE / R. Rose, O. Golosova, D. Sukhomlinov, A. Tiunov, M. Prosperi // Bioinformatics. - 2019. - Vol. 11. - P. 1963-1965. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty901.

14. Camacho C. ElasticBLAST: accelerating sequence search via cloud computing / C. Camacho, G. M. Boratyn, V. Joukov, R. Vera Alvarez, T. L. Madden // BMC Bioinformatics. - 2023. - Vol. 1. - P. 117. https://doi.org/10.1186/s12859-023-05245-9.