Эффективность соматического клонирования овец в зависимости от условий слияния и подготовки кариопластов

Целью данного исследования было оценить влияние кратности электрослияния на результативность клонирования у овец и зависимость данного влияния от продолжительности сывороточного голодания соматических клеток.
Материалы и методы. В качестве донорских клеток при проведении соматического клонирования была использована культура фетальных фибробластов IV-V пассажа. С целью остановки СК в фазе G0/G1 цикла при достижении ими монослоя с конфлюэнтностью, близкой к 90 %, продолжали культивирование в условиях сывороточного голодания (СГ) в течение 24 и 48 часов. Ооциты-реципиенты выделены из яичников овец, полученных post-mortem, созревали in vitro и были реконструированы путем энуклеации и переноса в перивителлиновое пространство СК. Способом объединения комплексов ооцит/СК являлось электрослияние – применение двух последовательных импульсов постоянного тока напряжением 40 В и продолжительностью 20 мкс в буфере, содержащем 270 мМ маннитола. Неслившиеся после первого воздействия комплексы подвергали повторному слиянию. Полученные цитогибриды активировали иономицином с последующей 4-х часовой инкубацией в присутствии 6-диметиламинопурина и циклогексимида, а затем культивировали в течение 48 часов с целью эмбрионального развития.
Результаты. В ходе проведения данного исследования было реконструировано 504 ооцита. Обнаружено статистически значимое более высокое количество раздробившихся цитогибридов, полученных от первого слияния, при использовании в качестве кариопластов фетальных фибробластов, подвергавшихся 48-часовому СГ. Количество эмбрионов, полученных при повторном слиянии, не зависело от продолжительности СГ соматических клеток. При применении СК, подвергавшихся 48-часовому СГ, обнаруживаются статистически значимые различия между долей раздробившихся цитогибридов, полученных при первом и повторном слиянии: 62,2±21,48 % и 31,4±26,43 % ,соответственно (р=0,010). Доля раздробившихся цитогибридов, полученных в ходе повторного слияния, составляет 35,2 % и 28,6 % от общего числа клонированных эмбрионов при 24- и 48-часовом СГ, соответственно, что вносит существенный вклад в общее число полученных эмбрионов ранних стадий развития. Результаты, приведенные в данной статье, можно интерпретировать как предварительные, поскольку продолжение настоящего исследования актуально как с точки зрения получения эмбрионов более поздних стадий развития, так и с целью определения их качества

1. Wilmut I. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells / I. Wilmut, A. Schnieke, J. McWhir, Kind A. J., Campbell K. H. // Nature. – 1997. – Vol. 385. — № 6619. – P. 810–813.

2. Srirattana K. Strategies to improve the efficiency of somatic cell nuclear transfer / K. Srirattana, M. Kaneda, R. Parnpai // International journal of molecular sciences. – 2022. – Vol. 23. – Article number 1969.

3. Liu L. Nuclear transfer and cloning / L. Liu // Transgenic mouse. Methods in molecular biology / ed. M. Larson. – New York: Humana, 2020. – Vol. 2066. – P. 113–124.

4. Demir K. Effects of serum starvation and ionomycin activation on the development of somatic cell nuclear transfer embryos in sheep / K. Demir, S. Pabuccuoglu, U. Cirit, M. Evecen, E. Karaman, O. B. Ozdas, S. Alkan, H. Atalla, S. Birler // Ankara Universitesi Veteriner Fakultesi Dergisi. – 2019. – Vol. 66. – P. 37–42.

5. Al-Ghadi M. Q. The in vitro development of cloned sheep embryos treated with Scriptaid and Trichostatin (A) / M. Q. Al-Ghadi, A. R. Alhimaidi, D. Iwamoto, M. G. Al-Mutary, A. A. Ammari, K. O. Saeki, M. S. Aleissa // Saudi Journal of Biological Sciences. – 2020. – Vol. 27, № 9. – P. 2280–2286.

6. Xu J. Cell synchronization by Rapamycin improves the developmental competence of buffalos (Bubalus bubalis) somatic cell nuclear transfer embryos / J. Xu, P. Shi, X. Zhao, P. Shen, Feng Y., Lu F., Shi D. // Reproduction in Domestic Animals. – 2021. – Vol. 56. – P. 313–323.

7. Yao Y. Melatonin promotes the development of sheep transgenic cloned embryos by protecting donor and recipient cells / Y. Yao, A. Yang, G. Li, H. Wu, S. Deng, H. Yang, W. Ma, D. Lv, Y. Fu, P. Ji, X. Tan, W. Zhao, Z. Lian, L. Zhang, Liu G. // Cell Cycle. – 2022. – Vol. 21. — № 13. – P. 1360–1375.

8. Song B. S. Inactivated Sendai-virus-mediated fusion improves early development of cloned bovine embryos by avoiding endoplasmic-reticulum-stress-associated apoptosis // B. S. Song, J. S. Kim et al.// Reproduction, Fertility and Development. – 2011. – Vol. 23. — № 6. – P. 826–836.

9. Moutos C. A novel method of somatic cell nuclear transfer to generate artificial oocytes / C. Moutos, P. Xie et al. // Human Reproduction. – 2024. – Vol. 39. — Suppl.1. – Article deae108.1108.

10. Sims M. Production of calves by transfer of nuclei from cultured inner cell mass cells / M. Sims, N. L. First // Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. – 1994. – Vol. 91. — № 13. – P. 6143–6147.

11. Tesarik J. Chemically and mechanically induced membrane fusion: non-activating methods for nuclear transfer in mature human oocytes / J. Tesarik, Z.P. Nagy, C. Mendoza, E. Greco // Human Reproduction. – 2000. – Vol. 15. — № 5. – P. 1149–1154.

12. Ma Y. Recent advances in critical nodes of embryo engineering technology / Y. Ma, M. Gu et al. // Theranostics. – 2021. – Vol. 11. – № 15. – P. 7391–7424.

13. Melican D. Effect of serum concentration, method of trypsinization and fusion/activation utilizing transfected fetal cells to generate transgenic dairy goats by somatic cell nuclear transfer / D. Melican, R. Butler et al. // Theriogenology. – 2005. – Vol. 63. — № 6. – P. 1549–1563.

14. Li W. Selenoprotein W as a molecular target of d-amino acid oxidase is regulated by d-amino acid in chicken neurons // W. Li, M. Talukder, X. T. Sun, C. Zhang, X. N. Li, J. Ge, J. L. Li // Metallomics: integrated biometal science. – 2018. – Vol. 10. – P. 751–758.

15. Matoba S. Somatic cell nuclear transfer reprogramming: mechanisms and applications / S. Matoba, Y. Zhang // Cell Stem Cell. – 2018. – Vol. 23. – № 4. – P. 471–485.

16. Campbell K. H. S. Nuclear-cytoplasmic interactions during the first cell cycle of nuclear transfer reconstructed bovine embryos: implications for deoxyribonucleic acid replication and development / K. H. S. Campbell, W. A. Ritchie, I. Wilmut // Biology of Reproduction. – 1993. – Vol. 49. – № 5. – P. 933–942.

17. Cervera R. P. Primate and human somatic cell nuclear transfer / R. P. Cervera, S. Mitalipov // Biology and pathology of the oocyte: Role in fertility, medicine, and nuclear reprogramming / ed. A. Trounson, R. Gosden, U. Eichenlaub-Ritter. – 2nd ed. – Cambridge: Cambridge University Press, 2013. – P. 274–284.

18. Wu B. Dynamics of maturation-promoting factor and its constituent proteins during in vitro maturation of bovine oocytes / B. Wu, G. Ignotz, W. B. Currie, X. Yang // Biology of Reproduction. – 1997. – Vol. 56. – № 1. – P. 253–259.

19. Kato Y. Role of the donor nuclei in cloning efficiency: can the ooplasm reprogram any nucleus? / Y. Kato, Y. Tsunoda // The International Journal of Developmental Biology. – 2010. – Vol. 54. – № 11–12. – P. 1623–1629.

20. Жукова А. С. Способы синхронизации клеточного цикла кариопластов для повышения результативности соматического клонирования сельскохозяйственных животных / А. С. Жукова // Гены и клетки. – 2024. – Т. 19. – № 3.

21. Park H. J. Effect of roscovitine treated donor cells on development of porcine cloned embryos / H.J. Park, O. J. Koo, D. K. Kwon, Kang J. T., Jang G., Lee B. C. // Reproduction in Domestic Animals. – 2010. – Vol. 45. – № 6. – P. 1082–1088.

22. Zhang Y. Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) alleviates endoplasmic reticulum stress of nuclear donor cells under serum starvation / Y. Zhang, P. Qu, X. Ma et al. // PLoS One. – 2018. – Vol. 13. – № 5. – Article number e0196785.

23. Сингина Г. Н. Влияние условий подготовки ооцитов и донорских клеток на эффективность соматического клонирования у домашней овцы (Ovis aries L.) / Г. Н. Сингина, А. В. Лопухов, Е. Н. Шедова, А. С. Жукова // Сельскохозяйственная биология. – 2024. – Т. 59. – № 4. – С. 692–703.

24. Сингина Г. Н. Результаты получения и трасплантации IVEP эмбрионов у овец (Ovis aries) / Г. Н. Сингина, В. А. Луканина, Е. Н. Шедова, Р. Ю. Чинаров, Е. А. Гладырь, Е. В. Цындрина // Сельскохозяйственная биология. – 2023. – Т. 58. – № 6. – С. 1088–1099.

25. Шедова Е. Н. Влияние продолжительности воздействия циклогексимида и 6-диметиламинопурин (6-ДМАП) на развитие клонированных эмбрионов крупного рогатого скота. / Е. Н. Шедова, А. В. Лопухов // Генетика и разведение животных. – 2020. – №4. – C. 85–91.

26. Koo D.B. In vitro development of reconstructed porcine oocytes after somatic cell nuclear transfer / D.B. Koo, Y.K. Kang et al. // Biology of Reproduction. – 2000. – Vol. 63. – P. 986–992.

27. Tani T. Direct exposure of chromosomes to nonactivated ovum cytoplasm is effective for bovine somatic cell nucleus reprogramming / T. Tani, Y. Kato, Y. Tsunoda // Biology of Reproduction. – 2001. – Vol. 64. — № 1. – P. 324–330.

28. Atabay E. C. Effect of activation treatments of recipient oocytes on subsequent development of bovine nuclear transfer embryos / E. C. Atabay, S. Katagiri, M. Nagano, Y. Takahashi // Japanese Journal of Veterinary Research. – 2003. – Vol. 50. – № 4. – P. 185–194.

29. Wang W. Electrofusion stimulation is an independent factor of chromosome abnormality in mice oocytes reconstructed via spindle transfer / W. Wang, S. Shao et al. // Frontiers in Endocrinology (Lausanne). – 2021. – Vol. 12. – Article number 705837.

30. Qu P. Melatonin protects rabbit somatic cell nuclear transfer (SCNT) embryos from electrofusion damage / P. Qu, C. Shen, Y. Du, H. Qin, S. Luo, S. Fu, Y. Dong, S. Guo, F. Hu, Y. Xue, E. Liu // Scientific Reports. – 2020. – Vol. 10. – Article number 2186.

31. Сингина Г. Н. Развитие клонированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro в зависимости от параметров слияния и активации / Г. Н. Сингина, А. В. Лопухов, Е. Н. Шедова // Сельскохозяйственная биология. – 2020. – Т. 55. – № 2. – С. 295–305.