Влияние продолжительности воздействия циклогексимида и 6-диметиламинопурин (6-ДМАП) на развитие клонированных эмбрионов крупного рогатого скота

Циклогексимид и 6-диметиламинопурин (6-ДМАП) широко используются в протоколах по клонированию ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer, SCNT) для ингибирования активности MPF (maturation promoting factor) в SCNT-ооцитах в пост-активационный период их культивирования. Тем не менее, следует помнить, что данные вещества обладают широким спектром действия и могут мешать другим клеточным процессам. Определение оптимального периода культивирования SCNT-ооцитов в присутствии указанных выше ингибиторов, очевидно, может способствовать предотвращению нежелательных негативных последствий. В данной работе влияние продолжительности воздействия 6-ДМАП (2 mM) и циклогексимида (10 мкг/мл) (3,0, 4,0 или 5,0 часов) на перепрограммирование соматического ядра, оценивали по способности активированных SCNT-ооцитов вступать в первое деление дробление и достигать стадии бластоцисты, а также по общему числу ядер и уровню апоптоза в полученных бластоцистах. Доля раздробившихся ооцитов, не различалась между экспериментальными группами, и варьировала от 63,7 до 77,0 %. Кроме того, не обнаружено влияние продолжительности воздействия исследуемых факторов на развитие активированных цитогибридов до стадии бластоцисты. При воздействии в течение 3,0 ч выход бластоцист составлял 19,6±1,8 %. Удлинение продолжительности культивирования до 4,0 и 5,0 ч не изменяло данный показатель. Тем не менее выявлено влияние длительности культивирования в присутствии циклогексимида и 6-ДМАП на качество клонированных эмбрионов. В случае воздействия указанных ингибиторов в течение 3 ч среднее число ядер в бластоцистах было 58,8±2,4. С увеличением продолжительности до 4 часов данный показал возрастал до 76,6±1,4 (p<0,05), а более длительное воздействие (5 часов) ухудшало качество бластоцист по сравнению с 4-х часовым периодом (p<0,05). Доля ядер в эмбрионах с признаками апоптоза не различалась между экспериментальными группами и варьировала от 5,4 до 7,0 %. Таким образом, нами подтверждено, что эффективность получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота предимплантационных стадий развития зависит от времени воздействия 6-ДМАП и циклогиксимида на SCNT-ооцитах в пост-активационный период их культивирования in vitro. Оптимальной продолжительностью применительно к описанному нами протоколу SCNT с точки зрения качества эмбрионов является 4 часа.

1. Brophy B. Cloned transgenic cattle produce milk with higher levels of beta-casein and kappa-casein / B. Brophy, G. Smolenski, T. Wheeler, D. Wells, P. L’Huillier, G. Laible // Nature Biotechnology. – 2003. – Vol. 21. – P. 157–162. doi: 10,1038/nbt783.

2. Richt J. A. Production of cattle lacking prion protein / J. A. Richt, P. Kasinathan, A. N. Hamir, J. Castilla et. al. // Nature Biotechnology. – 2007. – Vol. 25. – P.132–138. doi: 10.1038/nbt1271.

3. Wu H. TALE nickase-mediated SP110 knock in endows cattle with increased resistance to tuberculosis / H. Wu, Y. Wang, Y. Zhang, M. Yang, J. Lv, J. Liu, Y. Zhang // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2015. – Vol. 112(13). – E1530–E1539. doi: 10.1073/pnas.1421587112.

4. Proudfoot C. Genome edited sheep and cattle / C. Proudfoot, D. F. Carlson, R. Huddart, C. R. Long, J. H. Pryor, T. J. King, S. G. Lillico, A. J. Mileham, D. J. McLaren, C. B. Whitelaw, S. C. Fahrenkrug // Transgenic Research. – 2015. – Vol. 24(1). – P. 147–153. doi: 10,1007/s11248-014-9832-х.

5. Gao Y. Single Cas9 nickase induced generation of NRAMP1 knockin cattle with reduced off-target effects / Y. Gao, H. Wu, Y. Wang, X. Liu, L. Chen, Q. Li, C. Cui, X. Liu, J. Zhang, Y. Zhang // Genome biology. – 2017. – Vol. 18(1). – P. 13 doi:10.1186/s13059-016-1144-4.

6. Farin P.W. Errors in development of fetuses and placentas from in vitro-produced bovine embryos / P. W. Farin, J. A. Piedrahita, C. E. Farin // Theriogenology. – 2006. – Vol. 65. – P. 178-191. doi: 10.1016/j.theriogenology.2005.09.022.

7. Bertolini M. Developmental problems during pregnancy after in vitro embryo manipulations / M. Bertolini, L. R. Bertolini, R. P. C. Gerger, C. A. Batchelder, G. B. Anderson // Rev. Bras. Reprod. Anim. – 2007. – Vol. 31. – P. 391-405.

8. Su J. Aberrant mRNA expression and DNA methylation levels of imprinted genes in cloned transgenic calves that died of large offspring syndrome / J. Su, Y. Wang, Q. Liu, B. Yang, Y. Wu, Y. Luo, G. Hu, Y. Zhang // Livestock Science. – 2011. – Vol. 141. – P. 24–35. doi: 10.1016/j.livsci.2011.04.012.

9. Latham K. E. Early and delayed aspects of nuclear reprogramming during cloning / K. E. Latham // Biol. Cell. – 2005. – Vol. 97. – P. 119–132. doi: 10.1042/BC20040068.

10. Milazzotto M. P. Effect of chemical or electrical activation of bovine oocytes on blastocyst development and quality / M. P. Milazzotto, W. B. Feitosa, A. R. S. Coutinho, M. D. Goissis et. al. // Reprod. Dom. Anim. – 2008. – Vol. 43. – P. 319–322. doi: 10.1111/j.1439-0531.2007.00900.x.

11. Wakai T. Artificial activation of mammalian oocytes for cloning / T. Wakai, I. Ito, R.A. Fissore // Pinciples of cloning. – 2014. – P. 3-10. doi: 10.1016/B978-0-12-386541-0.00001-1.

12. Susko-Parrish J.L. Inhibition of protein kinases after an induced calcium transient causes transition of bovine oocytes to embryonic cycles without meiotic completion / J. L. Susko-Parrish, M. L. Leibfried-Rutledge, D. L. Northey, V. Schutzkus, N. L. First // Dev Biol. – 1994. – Vol. 166. – P. 729–739. doi: 10.1006/dbio.1994.1351.

13. Akagi S. Timing of the first cleavage and in vitro developmental potential of bovine somatic cell nuclear transfer embryos activated by different protocols / S. Akagi, S. Tamura, K. Matsukawa // Cellular Reprogramming. – 2020. – Vol. 22(1) P. 36-42. doi: 10.1089/cell.2019.0074.

14. Vichera G. Chemical activation with a combination of ionomycin and dehydroleucodine for production of parthenogenetic, ICSI and cloned bovine embryos / G. Vichera, J. Alfonso, C.C. Duque, M.A. Silvestre, F. Pereyra-Bonnet, R. Fernández-Martín and D. Salamone // Reprod. Domest. Anim. – 2010. – Vol. 45. – P. 306-312.

15. Akagi S. Recent progress in bovine somatic cell nuclear transfer / S. Akagi, M. Geshi, T. Nagai // Animal Science Journal. – 2013. Vol. 84(3). – P. 191-199. doi: 10.1111/asj.12035). 16.

16. Ross P. J. Bovine somatic cell nuclear transfer / P. J. Ross, J. B. Cibelli // Cellular Programming and Reprogramming. – 2010. – Vol. 636. – P. 155-177. doi: 10.1007/978-1-60761-691-7_10.

17. Bavister B.D. Development of preimplantation embryos of the golden hamster in a defined culture medium / B. D. Bavister, M. L. Liebfried, G. Lieberman // Biology of Reproduction. – 1993. – Vol. 28. – P. 235–247. doi: 10.1095/biolreprod28.1.235.

18. Rosenkrans C. F. Jr. Effect of free amino acids and vitamins on cleavage and develop-mental rate of bovine zygotes in vitro / C. F. Jr. Rosenkrans, N. L. First // Journal of Animal Science. – 1994. – Vol. 72(2). – P. 434-437. doi: 10.2527/1994.722434x.

19. German S. D. Livestock somatic cell nuclear transfer. In: Sustainable food production / S. D. German, K. H. S. Campbell P. Christou, R. Savin, B. A. Costa-Pierce, I. Misztal, C. B. A. Whitelaw (eds.) Springer, New York. – 2013. – P. 1067-1095. doi: 10.1007/978-1-4614-5797-8_2.

20. Lan G. C. Effects of duration, concentration, and timing of ionomycin and 6‐dimethylaminopurine (6‐DMAP) treatment on activation of goat oocytes / G. C. Lan, D. Han, Y. G. Wu, Z. B. Han, S. F. Ma, X. Y. Liu, C.L. Chang, J. H. Tan // Molecular Reproduction Development. – 2005. – Vol. 71(3). – P. 380-8. doi: 10.1002/mrd.20267.