Оценка качества и устойчивости к возрастным изменениям ооцитов коров при созревании в однофазной и двухфазной системах культивирования

Цель: изучение степени созревания и состояния хромосом в зрелых и стареющих ооцитах коров, созревающих в однофазной (1-фазной) и двухфазных (2-фазных) системах культивирования, а также оценка влияния эндогенного прогестерона на завершающем этапе созревания на данные показатели. 
Материалы и методы. В данной работе проведено сравнительное исследование ядерного созревания и аномального изменения хромосом на стадии MII в ооцитах коров, созревающих в 1-фазной и различных 2-фазных системах IVM (in vitro maturation, созревание in vitro). Кроме того, впервые изучено влияние исследуемых условий на качество хромосом в процессе последующего старения зрелых яйцеклеток. При использовании 1-фазной системы IVM ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) культивировали в течение 24 ч в среде ТС-199, которая содержала 10% фетальную бычью сыворотку (ФБС), 10 мгк/мл фолликулостимулирующего (ФСГ) и 10 мкг/мл лютеинизирующего (ЛГ) гормонов. В 2-фазной системе ооциты созревали в тех же условиях в течение первых 16 ч, а затем в новой среде (ТС-199, содержащей 10% ФБС (контроль), или в этой же среде, дополненной 50 нг/мл прогестерона) в течение оставшихся 8 ч. После созревания в 1-фазной и 2-фазной системах часть ОКК переносили в среду старения (ТС-199, содержащую 10% ФБС) и дополнительно культивировали еще 24 часа. Состояние ядерного материала (стадия мейоза и аномальные изменения MII-хромосом) в зрелых и стареющих ооцитах оценивали с помощью цитогенетического анализа. 
Результаты. Доля созревших ооцитов, находящихся на стадии MII мейоза через 24 ч созревания была сходной после 1-фазного и 2-фазного IVM и составила 82,7–86,3%. Кроме того, не выявлено влияния системы культивирования на долю MII-ооцитов с аномальными изменениями хромосом. Для 1-фазного культивирования данный показатель непосредственно после завершения периода IVM составил 32,2±0,5% и для 2-фазного 38,5±4,0%. При последующем старении ооцитов он возрастал до 56,9±2,9 и 68,4±3,0% соответственно. Эндогенный прогестерон в среде IVM (в течение последних 8 ч) также не влиял на степень завершения ядерного созревания, но снижал долю ооцитов с аномальными изменениями хромосом: после IVM как по сравнению с контролем, так и по сравнению с 1-фазным протоколом; после 24-часового пролонгированного культивирования по сравнению с контролем (P<0,05). 
Заключение. Полученные данные позволяют сделать вывод, что двухфазная система созревания ооцитов коров может применяться как альтернатива общепринятому протоколу IVM, и что прогестерон во второй фазе IVM обусловливает повышение качества яйцеклеток и их устойчивость к возрастным трансформациям.

1. Lonergan P. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts / ê. Lonergan, T. Fair // Theriogenology. — 2008. — Vol. 69. — P. 17-22. doi: 10.1016/j.theriogenology.2007.09.007.

2. Galli C. Bovine embryo technologies / C. Galli, R. Duchi, G. Crotti, P. Turini, N. Ponderato, S. Colleoni, I. Lagutina, G. Lazzari // Theriogenology. — 2003. — Vol. 59(2) — P. 599–616. doi: 10.1016/S0093691X(02)01243-8.

3. Ponsart ë. Reproductive technologies and genomic selection in dairy cattle / C. Ponsart, D. Le Bourhis, H. Knijn, S. Fritz, C. Guyader-Joly, T. Ottern, S. Lacaze, F. Charreaux, L. Schibler, D. Dupassieux, E. Mullaart // Reproduction, Fertility and Development. — 2013. — Vol. 26(1). — P. 12–21. doi: 10.1071/RD13328.

4. Wrenzycki C. Maturation environment and impact on subsequent developmental competence of bovine oocytes / C. Wrenzycki, H. Stinshoff // Reprod. Domest. Anim. — 2013. — Vol. 48 (Suppl. 1). — P. 38–43. doi: 10.1111/rda.12204.

5. Thompson J. G. Metabolism of the bovine cumulus-oocyte complex and influence on subsequent developmental competence / J. G. Thompson, M. Lane, R. B. Gilchrist // Soc. Reprod. Fertil. Suppl. — 2007. — Vol. 64. — P. 179–190.

6. Sudiman J. Bone morphogenetic protein 15 in the pro-mature complex form enhances bovine oocyte developmental competence / J. Sudiman, M. L. Sutton-McDowall, L. J. Ritter, M. A. White, D. G. Mottershead, J. G. Thompson, R. B. Gilchrist // PLoS ONE. — 2014. — Vol. 9(7). — e103563. doi: 10.1371/journal.pone.0103563.

7. Takahashi T. Cellular and molecular mechanisms of various types of oocyte aging / T. Takahashi, H. Igarashi, M. Amita, S. Hara, H. Kurachi // Reproductive Medicine and Biology. — 2011. — Vol. 10(4). — P. 239– 249. doi: 10.1007/s12522-011-0099-0.

8. Lebedeva I. Yu. Dynamics of morphofunctional changes in aging bovine ova during prolonged culture in vitro / I. Yu Lebedeva, G. N. Singina, A. V. Lopukhov, N. A. Zinovieva // Cell and Tissue Biology. — 2014. — Vol. 8(3). — P. 258–266. doi: 10.1134/S1990519X14030080.

9. Kong Q. Q. Cumulus cell released tumor necrosis factor (TNF)-α promotes post-ovulatory aging of mouse oocytes / Q.Q. Kong, J. Wang, B. Xiao, F. H. Lin, J. Zhu, G. Y. Sun, M. J. Luo, J. H. Tan // Aging (Albany NY). — 2018. — Vol. 10(7). — P. 1745–1757. doi: 10.18632/aging.101507.

10. Singina G. Pole of pituitary hormones and cumulus cells in modulating the developmental capacity of aging bovine oocytes / G. Singina, I. Lebedeva, T. Taradajnic, N. Zinovieva // Reproduction, Fertility and Development. — 2015. — Vol. 27(1) — P. 204.

11. Mingoti G. Z. Steroidogenesis in cumulus cells of bovine cumulus-oocyte-complexes matured in vitro with BSA and different concentrations of steroids / G. Z Mingoti, J. M. Garcia, A. A. Rosa-e-Silva // Anim. Reprod. Sci. — 2002. — Vol. 69. — P. 175–186. doi: 10.1016/S0378-4320(01)00187-7.

12. Tosca L. Possible role of 5’AMP-activated protein kinase in the metformin-mediated arrest of bovine oocytes at the germinal vesicle stage during in vitro maturation / L. Tosca, S. Uzbekova, C. Chabrolle, J. Dupont // Biol. Reprod. — 2007. — Vol. 77(3). — P. 452–465. doi: 10.1095/biolreprod.107.060848.

13. Fair T. The role of progesterone in oocyte acquisition of developmental competence / T. Fair, P. Lonergan // Reprod. Domest. Anim. — 2012. — Vol. 47 (Suppl. 4). — P. 142–147. doi: 10.1111/j.14390531.2012.02068.x.

14. Takahashi T. Molecular mechanism of poor embryo development in postovulatory aged oocytes: mini review. / T. Takahashi, H. Igarashi, M. Amita, S. Hara, K. Matsuo, H. Kurachi // J. Obstet. Gynaecol. Re. — 2013. — Vol. 39(10) — P. 1431–1439. doi: 10.1111/jog.12111.

15. Miao Y. L. Oocyte aging: cellular and molecular changes, developmental potential and reversal possibility / Y. L. Miao, K. Kikuchi, Q. Y. Sun, H. Schatten // Hum. Reprod. — 2009. — Vol. 15. — P. 573–585. doi: 10.1093/humupd/dmp014.