Трилон-Б (ЭДТА-NA₂) – антикоагулянт для гемолимфы австралийского красноклешневого рака (Cherax quadricarinatus)

Цель: подбор антикоагулянтов на основе Трилона-Б и методик их применения для работы с гемолимфой австралийского красноклешневого рака (C. quadricarinatus).

Материалы и методы. Для проведения исследования использованы разноразмерные самцы и самки австралийского красноклешневого рака (Cherax quadricarinatus (Von Martens, 1868)). В качестве антикоагулянта использовался Трилон-Б (ЭДТА-Na₂), концентрация которого составляла 4 %. Шприц объемом 2 мл с иглой 23G для изъятия гемолимфы предварительно промывали с оставлением в игле и подыгольном конусе антикоагулянта (около 1/3 объема подыгольного конуса заполняли раствором). Эксперимент представлен следующими сериями: 1. различия между общим числом гемоцитов (ОЧГ) и долей гранулоцитов в нативной гемолимфе и обработанной небольшим количеством Трилона-Б; 2. различия в содержании общего белка гемолимфы в нативной и обработанной небольшим количеством Трилоном-Б гемолимфе; 3. изменение общего числа гемоцитов (ОЧГ) и доли гранулоцитов в гемолимфе, обработанной небольшом количеством Трилона-Б сразу после отбора пробы и через сутки. Для проведения работ использовали выборки по 20 особей, при этом для первых двух серий из каждой изымали по две пробы гемолимфы, из третьей – одну. Шприцы с гемолимфой обработанной антикоагулянтом хранили в холодильнике при температуре 8,5°С. Дополнительно проводили аналогичные исследования различия ОЧГ и доли гранулоцитов в гемолимфе сразу же после отбора пробы с обработкой многокомпонентным антикоагулянтом, состоящим из 4 г Трилона-Б, 3 г цитрата натрия, 2 г глюкозы и 1 г NaCl на 100 мл дистиллированной воды. Гемолимфу отбирали шприцом из вентрального синуса. Проводили определение трех показателей: общее число гемоцитов (ОЧГ), доля гранулоцитов и общее содержание белка. Подсчет гемоцитов и определение доли гранулоцитов производили в камере Горяева под световым микроскопом. Общий белок определяли рефрактометрическим методом.

Результаты. В результате исследования выявлены достоверные различия в доли гранулоцитов (p<0,05), которых на 32 % больше в обработанной антикоагулянтом, чем в нативной гемолимфе что может объясняться равномерным распределением всех типов гемоцитов в образце. По остальным показателям всех серий достоверных различий выявлено не было. Исследования гемолимфы обработкой многокомпонентным антикоагулянтом показали низкий уровень сохранности гемоцитов (p<0,05) и доли гранулоцитов по сравнению с показателями сразу после отбора, поэтому не отображены в работе.

Заключение. Полученные данные свидетельствуют о том, что существует возможность использования Трилона-Б (4 %) при работе с гемолимфой. Антикоагулянт препятствует образованию геля и быстрому разрушению гемоцитов, способствует равномерному распределению клеток в камере Горяева и позволяет применять рефрактометр при определении общего белка крови. Использование антикоагулянта способствует сохранению гемоцитов в течение суток, на уровне, позволяющем применять Трилон-Б на практике.

1. Лагуткина Л. Ю. Новый объект тепловодной аквакультуры – австралийский красноклешневый рак (Cherax quadricarinatus) / Л. Ю. Лагуткина, С. В. Пономарев // Вестник АГТУ. – 2008. – № 6. – С. 220-223.

2. Арыстангалиева В. А., Жигин А. В. Австралийский красноклешневый рак (Cherax quadricarinatus) – перспективный объект аквакультуры России // Состояние и пути развития аквакультуры в Российской Федерации в свете импортозамещения и обеспечения продовольственной безопасности страны: материалы национальной научно-практической конференции, Саратов, 4-5 октября 2016 г. Саратов, 2016. С. 5-9.

3. Лагуткина Л. Ю. Фактологическое обеспечение практик повышения эффективности выращивания тропических пресноводных видов / Л. Ю. Лагуткина, Е. Г. Кузьмина и др. // Вестник Астраханского государственного технического университета. Серия: Рыбное хозяйство. - 2020. - №2. - С. 94-105. https://doi.org/10.24143/2073-5529-2020-2-94-105

4. Bone J. W. Using biochemical markers to assess the effects of imposed temperature stress on freshwater decapod crustaceans: Cherax quadricarinatus as a test case / J. W. Bone, G. M. Renshaw, J. M. Furse, C. H. Wild // J Comp Physiol B. - 2014 Apr. - V. 185. - P. 291-301. https://doi.org/10.1007/s00360-014-0883-3

5. Wu D.-L. Effects of cold acclimation on the survival, feeding rate, and non-specific immune responses of the freshwater red claw crayfish (Cherax quadricarinatus) / D.-L. Wu, Z.-Q. Liu et al. // Aquaculture International. - 2018. - V. 26. - P. 557–567. https://doi.org/10.1007/s10499-018-0236-4

6. Sánchez-Salgado J. L. In vivo administration of LPS and β-glucan generates the expression of a serum lectin and its cellular receptor in Cherax quadricarinatus / J. L. Sánchez-Salgado, M. A. Pereyra et al. // Fish & Shellfish Immunology. - 2019. - V. 94. - P. 10-16. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2019.08.061

7. Лагуткина Л. Ю., Ахмеджанова А. Б., Шейхгасанов К. Г. Оценка гемоцитарной формулы австралийских раков // 64-я Международная научная конференция Астраханского государственного технического университета, посвященная 90-летнему юбилею со дня образования Астраханского государственного технического университета: материалы конференции, Астрахань, 20–25 мая 2020 года. Астрахань: Астраханский государственный технический университет, 2020. С. 239.

8. Li F. Crayfish hemocytes develop along the granular cell lineage / F. Li, Z. Zheng, H. Li, R. Fu, L. Xu, F. Yang // Scientific Reports. - 2021. - №11. - 13099. https://doi.org/10.1038/s41598-021-92473-9

9. Лагуткина Л. Ю. Гематологические и биохимические показатели гемолимфы австралийского красноклешневого рака / Л. Ю. Лагуткина, Е. М. Евграфова, Е. Г. Кузьмина, А. М. Мазлов // Вестник Астраханского государственного технического университета. - 2021. Серия: Рыбное хозяйство. - № 2. - С. 134-143. https://doi.org/10.24143/2073-5529-2021-2-134-143

10. Лагуткина Л. Ю. Биоиндикаторы констант гомеостаза внутренней среды ракообразных, культивируемых в различных условиях среды с целью получения товарной продукции / Л. Ю. Лагуткина, А. Б. Ахмеджанова, С. В. Пономарев, А. С. Мартьянов // Рыбоводство и рыбное хозяйство. - 2021. - Т. 189. - С. 57-69. https://doi.org/10.33920/sel-09-2110-05.

11. Jussilla J. Physiological responses of Astacid and Parastacid crayfishes (Crustacea: Decapoda) to conditions of intensive culture: doctoral dissertation. Kuopio. 1997. 136 p.

12. Paterson B. D. Prediction survival of western rock lobster Panuluris cygnus, using discriminant analysis of hemolymph parameters taken immediately following simulated handling treatments / B. D. Paterson, P. T. Spanogle et al. // New Zealand Journ. of Marine and Freshwater Research. - 2005. - V. 39. - P. 1129-1143.

13. Александрова E. H. Прижизненное определение физиологического статуса десятиногих ракообразных (Сrustacea: Decapoda) по гематологическим показателям / E. H. Александрова, Н. П. Кочева // Успехи физиологических наук. - 2010. - Т. 41. - № 2. - С. 51-67.

14. Корягина Н. Ю. Физиолого-биохимическая характеристика речных раков при выращивании в искусственных условиях: дис. … канд. биол. наук. М., 2010. 151 с.

15. Пронина Г. И. Комплексная прижизненная физиологическая оценка речных раков в аквакультуре / Г. И. Пронина, Н. Ю. Корягина // Теоретические и прикладные проблемы агропромышленного комплекса. - 2014. - Т. 21. - С. 46-49.

16. Новикова И. А., Ходулева С. А. Клиническая и лабораторная гематология: учеб. пособие. Минск, 2013, Выcш. шк. 446 с.

17. Некрасова И. И., Квочко А. Н., Цыганский Р. А., Шулунова А. Н., Сидельников А. И. Гематология: учебное пособие для вузов СПб, 2021. Лань. 208 с.

18. Soderhall K. Separation of the haemocyte populations of Carcinus maenus and other marine Decapods, and prophenoloxidase distribution / K. Soderhall, V. J. Smith // J. Developmental and Comparative Immunology. - 1983. - V. 7. - P. 229-239.

19. Hose J. E. A Decapod Hemocyte Classification Scheme, Integrating Morphology, Cytochemistry, and Function / J. E. Hose, G. G. Martin, A. S. Gerard // Biol. Bull. - 1990. - V. 178. - P.33-45.

20. Jussilla J. On physiological responses, hemolymph glucose, total hemocyte count and dehydration of marron (Cherax tenuimanus) to handling and transportation under simulated conditions / J. Jussilla, M. Paganini, S. Mansefield, L. H. Evans, // Freshwater Crayfish. - 1999. - V.12. - P. 154-167.

21. Lucic A. Seasonal changes of the condition indices and haemocyte counts of the Austropotamobius torrentium population in Kraljevec stream, Croatia / A. Lucic, R. Erben // Bull. Fr. Peche Piscic. - 2005. - V. 376-377. - P. 687-697.

22. Huang S. Association of the Genetic Polymorphisms in Pre-MicroRNAs with Risk of Ischemic Stroke in a Chinese Population / S. Huang, S. Zhou et al. // PLoS ONE. - 2015. - V. 10. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0117007

23. Дегтяревская Т. Ю. Реакция эозинофилов в крови молодняка овец при экспериментальном диктиокаулезе и после комплексного лечения / Т. Ю. Дегтяревская // Российский паразитологический журнал. - 2016. - Т. 37. - C. 370-373. https://doi.org/10.12737/21660

24. Пищенко Е.В. Гематология пресноводной рыбы: учеб. пособие. Новосибирск, 2002. Новосиб. гос. аграр. ун-т. 48 с.

25. Paterson B. D. Measuring total protein concentration in blood of the western rock lobster Panulirus cygnus by refractometry / B. D. Paterson, G. W. Davidson, P. T. Spanoghe // International Symposium on Lobster Health Management. 1999. Proceeding 19–21 September, Adelaide. P. 110-115.

26. Ковачева Н. П., Александрова Е. Н. Гематологические показатели как индикаторы физиологического состояния декапод: камчатского краба Paralithodes camtschaticus и речных раков родов Astacus и Pontastacus // Изд. ВНИРО. М., 2010, 91 с.

27. Jussila, J. Hemolymph clotting time as an indicator of stress in western rock lobster (Panulirus cygnus George) / J. Jussila, S. McBride, J. Jago, L. Evans // Aquaculture. - 2001. - V. 199. - P. 185-193. https://doi.org/10.1016/s0044-8486(00)00599-8

28. Иванов А. А., Пронина Г. И., Корягина Н. Ю. Физиология гидробионтов. СПб, 2021. 480 с.