Анализ показателей криорезистентности кумулюса ооцитов Ovis Arias после интра- или экстра-овариальной витрификации

Цель: идентификация эффектов наночастиц высокодисперсного кремнезема на показатели криорезистентности клеток кумулюса (уровень экспансии и статус хроматина) ооцитов Ovis Ariеs в условиях интра- или экстраовариальной витрификации.

Материалы и методы. Ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК), предназначенные для ЭОВ, обрабатывали растворами криопротекторов (КПА), приготовленных на ТС-199 с 10% ФБС (фетальной бычьей сывороткой): КПА-1-0.7 M диметилсульфоксид (ДМСО) + 0.9 M этиленгликоля (ЭГ); КПА-2-1.4 M ДМСО + 1.8 M ЭГ; КПА- 3- 2.8 M ДМСО + 3.6 M ЭГ + 0.65 M трегалозы. ОКК поэтапно экспонировали в течение 30 сек в КПА-1, 30 сек в КПА-2 и 20 сек в КПА-3. При ИОВ яичники животных делили на фрагменты и помещали в стерильных марлевых емкостях в КПА, приготовленных на основе Дюльбекко (PBS) с 20% ФБС: КПА-1 - 7,5% ЭГ + 7,5% ДМСО (25 мин), затем в КПА-2 – 15% ЭГ, 15% ДМСО и 0,5 М сахарозы (15 мин). В КПА и среды для оттаивания опытных групп вносили 0,001% нВДК (ИХП им. А.А. Чуйко НАН Украины). Пайеты с биоматериалом хранили в жидком азоте не менее 24 часов. ОКК извлекали из пайет после оттаивания и помещали последовательно на 3 мин: в 0,25 М раствор трегалозы в Т-199 с 10% ФБС при 37оС, затем в 0,19 М и, наконец, в 0,125М трегалозу. ОКК из оттаянных фрагментов последовательно обрабатывали 0,5 М (1 мин) и 0,25 М (5 мин) растворами сахарозы в PBS с 20% ФБС. Финальную отмывку всех ОКК проводили в ТС-199 с 10% ФБС.

Результаты. Результаты морфологического (характер ооцит-кумулюсных коммуникаций) и цитологического мониторинга (статус хроматина клеток кумулюса) выявили положительный эффект 0,001% нВДК на показатели криорезистентности ОКК как при ЭОВ, так и ИОВ. Доля клеток с компактным кумулюсом в группе ЭОВ гамет с использованием нВДК значительно превысило таковую в их отсутствии (69% против 51%, P<0,05). Аналогичная тенденция обнаружена при ИОВ (35% против 20%, P<0,05). Уровень апоптотических (TUNEL-test) клеток в группе ЭОВ (44% против 32%, P<0,05) и ИОВ (72% против 51%, P<0,001) гамет резко снижался при введении в состав криопротекторных сред нВДК, а доля пикнотических клеток уменьшилась при ЭОВ (с 31% до 21%, P<0,05), при ИОВ (с 58% до 41%, P<0,05) В целом полученные результаты свидетельствуют о целесообразности использования 0,001% нВДК в протоколах ИОВ и ЭОВ женских гамет Ovis Arias.

1. Hiemstra SJ, T. van der Lende, Woelders H. The potential of cryopreservation and reproductive technologies for animal genetic resources conservation strategies // The role of Biotechnology. Villa Gualino, Turin, Italy - 2005. - P. 25-36.

2. Fryc K. Morphokinetic changes in vitrified and non-vitrified in vitro-derived ovine embryos / Fryc K., Nowak A., Kij-Mitka B., Kochan J., Bartlewski P.M., Murawski M.// Theriogenology. - 2022. - Vol. 187. - P. 58-63. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2022.04.027

3. Falchi L, Ledda S, Zedda M.T. Embryo biotechnologies in sheep: Achievements and new improvements // Reprod in Domestic Animals. - 2022. - Vol. 47(5). - P. 865-871.

4. Moawad A.R. Campbell Caffeine and oocyte vitrification: Sheep as an animal model / Moawad A.R., Choi I., Zhu J., Abou Bakr A. EL-Wishy, Amarnath D., Chen W, Keith H.S. // International Journal of Veterinary Science and Medicin. - 2018. - P. 41-48. https://doi.org/10.1016/j.ijvsm.2018.01.004

5. Tharasanit T, Thuwanut P. Oocyte cryopreservation in domestic animals and humans: principles, techniques and updated outcomes // Animals. - 2021. - Vol. 11. - P. 2949. https://doi.org/103390/ani11102949

6. Robert C. // Reproduction, Fertility and Development. - 2022. - Vol. 34(1-Ý 2). - P. 149-159 https://doi.org/10.1071/RD21282

7. Marchais M. Mammalian cumulus oocyte complex communication: a dialog through long and short distance messaging / Marchais M, Gilbert I, Bastien A, Macaulay A, Robert C. // Journal of Assisted Reproduction and Genetics. - 2022. - Vol. 39(5). - P. 1011-1025. https://doi.org/10.1007/s10815-022-02438-8

8. Maside C. Oocyte Morphometric Assessment and Gene Expression Profiling of Oocytes and Cumulus Cells as Biomarkers of Oocyte Competence in Sheep / Maside C, Sánchez-Ajofrín I, Medina-Chávez D, Alves B, Garde JJ and Soler AJ. // Animals. - 2021. - Vol. 11(10). - P. 2818. https://doi.org/10.3390/ani11102818

9. Liberman Alexander Synthesis and surface functionalization of silica nanoparticles for nanomedicine / Liberman Alexander, Natalie Mendeza, William C. Troglerb, and Andrew C. Kummelb, // Surf Sci Rep. - 2014. - Vol. 69 (2-3). - P. 132-158. https://doi.org/10.1016/j.surfrep.2014.07.001

10. Shi Xi Chena Silver nanoparticles induce oocyte maturation in zebrafish (Danio rerio) / Shi Xi Chena, Xiao Zhen Yanga, Ying Denga, Jing Huanga, Yan Lib, Qian Sunb, Chang-Ping Yub, Yong Zhua, and Wan Shu Honga // Chemosphere. - 2017. - Vol. 170. - P. 51-60. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2016.12.016

11. Lucas Caroline G. Applications of omics and nanotechnology to improve pig embryo production in vitro / Lucas Caroline G., Paula R. Chen, Fabiana K. Seixas, Randall S. Prather, Tiago Collares // Mol Reprod Dev. - 2019. - Vol. 86(11). - P. 1531-1547. https://doi.org/10.1002/mrd.23260

12. Кузьмина Т.И., Станиславович Т.И. Влияние витрификации на статус хроматина ооцит-кумулюсных комплексов Sus Scrofa Domesticus. // Генетика и разведение животных. - 2019. - №1. - С. 27-33. https://doi.org/10.31043/2410-2733-2019-1-27-33

13. Кузьмина Т.И., Чистякова И.В. Влияние наночастиц высокодисперсного кремнезёма на апоптоз в нативных и девитрифицированных клетках гранулезы овариальных фолликулов Bos Taurus // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2019. - № 3 (43). - С. 8-12. https://doi.org/10.24411/2074-5036-2019-10031

14. Галаган Н.П. Влияние дисперсности нанокремнеземов на их биоактивность по отношению к гаметам быка / Н.П. Галаган, В.М. Гунько, Н.Г. Порхун, Е.А. Новикова, В.В. Туров // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. - 2012. - № 5. - C. 126-133.

15. Tarkowski A. An air-drying method for chromosomal preparation from mouse eggs // Cytogenetic. - 1966. - Vol. 1 - P. 394-400.

16. Appeltant R. Effects of vitrification of cumulus-enclosed porcine oocytes at the germinal vesicle stage on cumulus expansion, nuclear progression and cytoplasmic maturation. / Appeltant R., Somfai T., Santos E.C.S., Dang-Nguyen T.Q., Nagai T., Kikuchi K. // Reprod. Fertil. Dev. - 2017. - Vol. 29(12). - P. 2419-2429. https://doi.org/10.1071/RD16386

17. Wei J.H., Yuan X.Y., Zhang J.M., Wei J.Q. Caspase activity and oxida¬tive stress of granulosa cells are associated with the viability and developmental potential of vitrified immature oocytes. // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. - 2016. - Vol. 198. - P. 22-26. https://doi.org/10.1016/j.ejogrb.2015.12.010

18. Kokotsaki M. Impact of vitrification on granulosa cell survival and gene expression. / Kokotsaki M., Mairhofer M., Schneeberger C., Marschalek J., Pietrowski D. // Cryobiology. - 2018. - Vol. 85. - P. 73-78. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2018.09.006

19. Кузьмина Т.И., Чистякова И.В. Оценка компетентности к развитию ооцит-кумулюсных комплексов Sus Scrofa Domesticus (L.) после интра- и экстраовариальной витрификации // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2021. - Т. 25(6). - С. 613-619. https://doi.org/10.18699/VJ21.069

20. Кузьмина Т.И., Чистякова И.В., Татарская Д.Н. Функциональная активность митохондрий и статус хроматина нативных и девитрифицированных ооцитов Bos Taurus под воздействием наночастиц высокодисперсного кремнезема // Сельскохозяйственная биология. - 2020. - Т. 55. - № 4. - С. 784-793. https://doi.org/10.15389/agrobiology.2020.4.784