Влияние тестостерона на стимулированное соматотропином и теофиллином освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо ооцитов Sus Scrofa Domesticus

Цель: изучение влияния тестостерона на стимулированное соматотропином и теофиллином освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо ооцитов свиней.

Материалы и методы. Материалом для исследований служили ооциты, выделенные из антральных фолликулов (диаметром 3-6 мм) яичников Sus Scrofa Domesticus. Ооцит-кумулюсные комплексы аспирировали из яичников на стадии фолликулярного роста, без признаков видимой патологии. Выделенные ооциты инкубировали в модифицированной инкубационной среде Дюльбекко без СаСl₂, содержащей 36 мг/л пирувата Na и 1 г/л глюкозы. Содержание кальция во внутриклеточных депо ооцитов свиней измеряли с помощью флуоресцентного зонда хлортетрациклин (ХТЦ). Ооциты нагружали зондом в течение 5 мин при 370С в среде, содержащей 40 мкМ ХТЦ. Затем клетки три раза отмывали в инкубационной среде и переносили на специальное кварцевое стекло с ячейками объемом 0,05 мл. Зависимую от Са²⁺ флуоресценцию ХТЦ регистрировали в ооцитах в среде Дюльбекко. Интенсивность флуоресценции зонда ХТЦ измеряли на флуориметрической установке, состоящей из люминесцентного микроскопа, снабженного необходимыми светофильтрами и фотометрической насадкой ФМЭЛ-1А. Комплекс ХТЦ-Са2+- мембрана возбуждали светом 380-400 нм, флуоресценцию регистрировали в области 530 нм. Интенсивность флуоресценции измеряли в усл. ед. Длительность воздействия ультрафиолетового излучения на ооциты при проведении измерений не превышала 5 сек. Во всех экспериментах в среду инкубации добавляли ЭГТА в концентрации 0.5 мМ.

Результаты. Показано, что в отсутствии тестостерона в ооцитах добавление отдельно соматотропина (СТГ) или теофиллина стимулировало освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо, тогда как совместное их действие не приводило к дополнительному выходу Са²⁺ из внутриклеточных депо. Ингибирование протеинкиназы А не оказывало влияния на освобождение Са²⁺, стимулированное отдельно СТГ или теофиллином, а также их совместным действием. На фоне использования тестостерона добавление отдельно СТГ или теофиллина не приводило к освобождению Са²⁺ из внутриклеточных депо. При совместном действии СТГ и теофиллина в присутствии тестостерона отмечали освобождение Са2+ из внутриклеточных депо, причем величина этого показателя была выше, чем при совместном действии СТГ и теофиллина в отсутствии тестостерона. В стимулированном совместным действием СТГ и теофиллина освобождении Са²⁺ из внутриклеточных депо ооцитов в присутствии тестостерона участвует протеинкиназа А и микрофиламенты, так как при воздействии ингибиторов протеинкиназы А и полимеризации микрофиламентов цитохалазина выход Са²⁺ из внутриклеточных депо не регистрировали.

1. Franks S. Androgen action in the ovary // S. Franks, K. Hardy / Front. Endocrinol (Lausanne). – 2018. – Vol. 10. – № 9. – P. 452. doi: 10.3389/fendo.2018.00452

2. Brinkmann A. O. Molecular mechanisms of androgen action--a historical perspective / A. O. Brinkmann // Methods Mol. Biol. – 2011. – Vol. 776. – P. 3-24. doi: 10.1007/978-1-61779-243-4_1

3. Estrada M. Aldosterone- and testosterone-mediated intracellular calcium response in skeletal muscle cell cultures // M. Estrada, J. L. Liberona, M. Miranda, E. Jaimovich / Amer. J. Physiol. – 2000. – Vol. 279. – № 1. – P. 132-139. doi: 10.1152/ajpendo.2000.279.1.E132

4. Lieberherr M. Androgens increase intracellular calcium concentration and inositol 1,4,5-trisphosphate and diacylglycerol formation via a pertussis toxin-sensitive G-protein / M. Lieberherr, B. Grosse // J. Biol. Chem. – 1994. – Vol. 269. – № 10. – P. 7217-7223.

5. Chimote B. N. Dehydroepiandrosterone (DHEA) and its sulfate (DHEA-S) in mammalian reproduction: known roles and novel paradigms // B. N. Chimote, N. M. Chimote / Vit. Horm. – 2018. – Vol. 108. – P. 223-250. doi: 10.1016/bs.vh.2018.02.001

6. Ilondo M. M. Human growth hormone increases cytosolic free calcium in cultured human IM-9 lymphocytes: a novel mechanism of growth hormone transmembrane signalling / M. M. Ilondo, P. De Meyts, P. Bouchelouche // Biochem. Biophys. Res. Comm. – 1994. – Vol. 202. – № 1. – P. 391-397. doi: 10.1006/bbrc.1994.1940

7. Marrero I. Bovine growth hormone induced oscillations in cytosolic free Са2+ in single rat hepatocytes / I. Marrero, A.K. Green, P. H. Cobbold, C.J. Dixon // Biochem. – 1996. – Vol. 313. – № 2. – P. 525-528. doi: 10.1042/bj3130525

8. Silvestre F. [Ca2+]i rise at in vitro maturation in bovine cumulus-oocyte complexes / F. Silvestre, R. A. Fissore, E. Tosti, R. Boni // Mol. Reprod. Dev. – 2012. – Vol. 79. – № 6. – P. 369-379. doi: 10.1002/mrd.22038

9. Taylor C. W. Structural organization of signalling to and from IP3 receptors / C. W. Taylor, S. C. Tovey, A. M. Rossi, C. I. Lopez Sanjurjo, D. L. Prole, T. Rahman // Biochem. Soc. Trans. – 2014. – Vol. 42. – № 1. – P. 63-70. doi: 10.1042/BST20130205

10. Haji-Ghassemi O. The Cardiac Ryanodine Receptor Phosphorylation Hotspot Embraces PKA in a Phosphorylation-Dependent Manner / O. Haji-Ghassemi, Z. Yuchi, F. Van Petegem // Mol. Cell. – 2019. – Vol. 75. – № 1. – P. 39-52. doi: 10.1016/j.molcel.2019.04.019.

11. Filgueira F. P. Endogenous testosterone increases leukocyte-endothelial cell interaction in spontaneously hypertensive rats / F.P. Filgueira, N.S. Lobato, R.A. DosSantos, M. A. Oliveira, E. H. Akamine, R.C. Tostes, Z. B. Fortes, M. H. Carvalho // Life Sci. – 2012. – Vol. 90. – № 17-18. – P. 689-694. doi: 10.1016/j.lfs.2012.03.009

12. Verrecchia F. Nongenomic steroid action: Inhibiting effects on cell-to-cell communication between rat ventricular myocytes / F. Verrecchia, D. Sarrouilhe, J.C. Hervé // Exp. Clin. Cardio. – 2001. – Vol. 6. – № 3. – P. 124-131

13. Ghosh T. K. GTP-activated communication between distinct inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive and –insensitive calcium pools // T. K. Ghosh, J. M. Mullaney, F. I. Tarazy, D. L. Gill / Nature. – 1989. – Vol. 340. – № 6230. – P. 236-239. doi: 10.1038/340236a0

14. Денисенко В. Ю. Влияние ингибитора IP3-чувствительных рецепторов на стимулированное соматотропином освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней: Биологические ресурсы // В. Ю. Денисенко, Т. И. Кузьмина / Сб. статей междунар. науч.-практ. конференции. Киров. – 2010. – Т. 1. – С. 56-57

15. Lefkimmiatis K. Store-operated cyclic AMP signalling mediated by STIM1 / K. Lefkimmiatis, M. Srikanthan, I. Maiellaro, M. P. Moyer, S. Curci, A. M. Hofer // Nat. Cell Biol. – 2009. – Vol. 11. – № 4. – P. 433-442. doi: 10.1038/ncb1850

16. Galan C. The cytoskeleton plays a modulatory role in the association between STIM1 and the Ca2+ channel subunits Orai1 and TRPC1 / C. Galan, N. Dionisio, T. Smani, G. M. Salido, J. A. Rosado // Biochem. Pharm. – 2011. – Vol. 82. – № 4. – P. 400-410. doi: 10.1016/j.bcp.2011.05.017