Связь уровня активных форм кислорода в нативных сперматозоидах петухов с качественными показателями спермы до и после замораживания-оттаивания

Цель: изучение влияния уровня активных форм кислорода в нативных сперматозоидах петухов на качественные показатели свежеразбавленных и деконсервированных индивидуальных эякулятов (подвижность, повреждение клеточных мембран спермиев) и определение допустимого уровня генерации АФК для совершенствования протокола криоконсервации.

Материалы и методы. Объектом исследования являлись петухи породы род-айланд красный (n= 20) в возрасте 44 недели жизни. Все самцы содержались в индивидуальных клетках при принятой в БРК «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» ВНИИГРЖ системе кормления, поения и светового режима. Сперму получали в пенициллиновые флаконы объемом 10 мл при помощи метода абдоминального массажа. Измеряли объем каждого индивидуального эякулята, проводили оценку подвижности сперматозоидов, концентрацию. Криоконсервация производилась в гранулах. Оттаивание гранул проводилось при t 60°С в щелевом оттаивателе. Поврежденность плазматических мембран сперматозоидов в нативном и деконсервированном семени оценивали при помощи метода суправитальной окраски по Блюму. Сперматозоиды с поврежденными мембранами окрашивались в красный цвет, интактные клетки оставались белыми (бесцветными). В каждом препарате оценивалось не менее 200 клеток. Для определения уровней генерации АФК в сперматозоидах петухов использовали метод, основанный на люминол-пероксидазной хемилюминесценции, которую измеряли на хемилюминометре Lum-1200. Время проведения каждого измерения составляло 3 часа, основываясь на кривой хемилюминисценции активных форм кислорода (учитывая рост показателя, пик и спад). Концентрация клеток (7х106 кл./мл) для проведения измерений подбиралась экспериментальным путем по результатам серии предварительных экспериментов.

Результаты. В результате исследования впервые получены данные, основанные на методе люминолпероксидазной хемилюминесценции по допустимому уровню АФК в нативной сперме петухов. Установлен диапазон активных форм кислорода (от 75 до 249 Вольт*сек), при котором клетки не получают значительных повреждений мембранных структур при криоконсервации. При превышении порога равного 250 Вольт*сек количество клеток с поврежденными мембранами резко увеличивается с 17,19% до 62,87%. Полученные данные позволяют проводить оценку и отбор петухов по качеству их спермы для целей криоконсервации и формирования криобанков репродуктивных клеток.

1. Курочкин А. Фертильность заморожено/оттаянного семени петухов в зависимости от стартовой температуры криоконсервации / А. Курочкин, Н. Плешанов // Зоотехния. – 2020. – № 12. – С. 26-29

2. Bui A. D. Reactive oxygen species impact on sperm DNA and its role in male infertility / A. D. Bui, R. Sharma, R. Henkel, A. Agarwal // Andrologia. – 2018. – № 50(8): e 13012

3. O'Flaherty C. Redox regulation of mammalian sperm capacitation / C. O'Flaherty // Asian Journal of Andrology. – 2015. – №17(4). – P. 583-590

4. Upadhyay V. R. Bimodal interplay of reactive oxygen and nitrogen species in physiology and pathophysiology of bovine sperm function / V. R. Upadhyay, V. Ramesh, R. K. Dewry, D. K. Yadav, P. Ponraj // Theriogenology. – 2022. – № 15; 187. – P. 82-94

5. Баженов И. Роль окислительного стресса в патогенезе мужского бесплодия / И. Баженов, E. Филиппова // Эффективная фармакотерапия. – 2018. – № 29. – С. 50-58

6. Saleh R. Oxidative stress, and male infertility: from research bench to clinical practice / R. Saleh, A. Agarwal // Journal of Andrology. – 2002. – № 23(6). – P. 737-752

7. Cerolini S. Effect of docosahexaenoic acid and a-tocopherol enrichment in chicken sperm on semen quality, sperm lipid composition and susceptibility to peroxidation / S. Cerolini, L. Zaniboni, A. Maldjian, T. Gliozzi // Theriogenology. – 2006. – №66. – P. 877-886

8. Leаo A. P. A. Antioxidant enrichment of rooster semen extenders – A systematic review / A. P. A. Leаo, A. V. Souza, N. F. Mesquita, L. J. Pereira, M. G. Zangeronimo // Research in Veterinary Science. – 2021. – №136. – P. 111-118

9. Mehaisen G. M. K. Cryoprotective effect of melatonin supplementation on post-thawed rooster sperm quality / G. M. K. Mehaisen, A. Partyka, Z. Ligocka, W. Niżanski // Animal Reproduction Science. – 2020. – 106238

10. Surai P. Polyunsaturated fatty acids, lipid peroxidation and antioxidant protection in avian semem / P. Surai, N. Fujihara, B. Speake, J. Brillard, G. Wishart, N. Sparks // Asian Australasian journal of animal sciences. – 2001. – № 14. – P. 1024-1050

11. Burrows W. H. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey / W. H. Burrows, J. P. Quinn // Poultry Science. – 1937. – № 16. – P. 19-24

12. Тур Б. К., Богомолов В. В. Среда для разбавления спермы птиц “ВНИИГРЖ”. АС № 2482816, РФ, 2013

13. Курбатов А. Д., Нарубина Л. Е., Бубляева Г. Б., Москаленко Л. И., Целютин К. В. Среда для низкотемпературной консервации спермы птиц. АС № 1130339, СССР, 1984

14. Нарубина Л. Е., Курбатов А. Д., Бубляева Г. Б., Целютин К. В. Способ криоконсервации спермы петухов в виде гранул. АС № 1343587, СССР, 1987.

15. Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека: научно-практическое издание / Перевод с английского Н. П. Макарова, под ред. Курило Л. Ф. 5-е изд. М.: Капитал принт, 2012. 292 с.

16. Владимиров Ю. Свободные радикалы и клеточная хемилюминеcценция / Ю. Владимиров, Е. Проскурнина // Успехи биологической химии. – 2009. – № 49. – С. 341-388

17. Aitken R. J. Electrophilic aldehydes generated by sperm metabolism activate mitochondrial reactive oxygen species generation and apoptosis by targeting succinate dehydrogenase / R. J. Aitken, S. Whiting, G. N. De Iuliis, S. Mcclymont, L. A. Mitchell // The journal of biological chemistry. – 2012. – V. 287. – № 39. – P. 33048-33060