Влияние процесса микроинъекции на выживаемость эмбрионов зебрафиш (Daniorerio) при получении трансгенных рыб

Рыбы относятся к удобным объектам исследования, т.к. они не дороги в содержании, имеют прозрачные оболочки, позволяющие легко анализировать стадии развития, продуцируют много оплодотворенной икры, необходимой для введения генов. Целью данной работы стало изучение влияния введения генетических конструкций методом микроинъекции на жизнеспособность трансгенных модельных эмбрионов и личинок рыб с флуоресцентными репортерными генами. При помощи микроманипулятора были введены две разные генные конструкции, содержащие репортерный ген GFP, в качестве контроля была микроинъецирована дистиллированная вода. Достоинством этих конструкций служит прижизненная экспрессия зеленого флуоресцентного белка при УФ облучении и применении фильтра ФИТЦ. Анализ стадий развития, морфологических изменений рыб и экспрессию генов изучали на стереомикроскопе Lumar 12 фирмы Zeiss. Уже через сутки анализ ранних стадий развития рыб как в контроле, так в экспериментальных группах показал наличие нормальных и аномальных форм развития. Кроме того, во всех исследуемых группах эмбрионов были выявлены нежизнеспособные организмы. Таким образом, именно первые сутки являются основным критическим периодом выживаемости эмбрионов. Всего было проанализировано 335 эмбрионов, среди которых в контроле 60, после введения воды 111, после введения конструкции pCX-EGFP 126 и 38 после введения генетической конструкции рCЕЕGFP. Впервые показана различная жизнеспособность эмбрионов и личинок в контроле и при использовании разных векторов. Выявлены критические периоды жизни ранних стадий развития в экспериментальных и контрольных группах рыб. Получены трансгенные эмбрионы и личинки Danio rerio с мозаичным характером экспрессии зеленого флуоресцентного белка GFP. Следует метить, что недостаточно изучено влияние генных модификаций на гомеостаз и продолжительность жизни генетически измененных организмов как на популяционном, клеточном, так и молекулярном уровнях. Необходимы дальнейшие исследования особенностей развития и продолжительности жизни трансгенных организмов.

трансгенные животные, плазмиды, репортерные гены, экспрессия генов, микроинъекция, генетические конструкции, эмбрионально-личиночное развитие, зебрафиш, выживаемость

1. Wu J. L. Zebrafish eggs used as bioreactors for the production of bioactive tilapia insulin-like growth factors / J. L. Wu, S. Y. Hu, C. H. Liao, Y. P. Lin, Y. H. Li, H. Y. Gong, G. H. Lin, K. Kawakami, T. H. Yang, J. L. Wu // Transgenic Res. - 2011. - V. 20. - Р. 73-83. doi: 10.1007/s11248-010-9388-3.

2. Исаева Н. М. Трансгенные рыбы: современное состояние проблемы. Н. М. Исаева, С. Ю. Морозов-Леонов // Цитология и генетика. - 2007. - № 4. - С.72-79.

3. Onichtchouk D. Transgene deriving GFP expression from the promoter of the zona pellucid gene zpc is expressed in oocytes and provides an early varker for gonad differentiation in zebrafish / D. Onichtchouk, K. Aduroja, H. Belting et al. // Dev. Dyn. - 2003. - V.228. - № 3. - P.393.

4. Козикова Л. В. Трансгенные животные: учебное пособие. Л. В. Козикова. // СПб. Проспект Науки. - 2017. - 224 с.

5. Микодина Е. В. Генетически модифицированные организмы (ГМО) и биологическая безопасность рыб в аквакультуре. Е. В. Микодина // Мат. II Межд. Научно-практическая конф. «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов». М. - 2008. - С.167-170.

6. Sumitaka H. Growth retardation and hair loss in transgenic mice overexpressing human H-ferritin gene / H. Sumitaka, H. Kazutoshi, M. Yukie, T. Satoshi, F. Takako, S. Tsuneo // TransgenicResearch. - 2013. - V. 22. - Issue 3. - P. 651-658.

7. Козикова Л. В. Суперлосось» и другие рыбы, устойчивые к холоду / Л. В. Козикова // Генетика и разведение животных. - 2018. - №1. - С.20-24.

8. Kozikova L. V. Transgenic animals and their use in agriculture / L. V. Kozikova, J. Bulla, P. Babusik, L. Kuliskova, J. Pivko, P. Uhrin // 5th International symposium «Biological and technical intensification of production and increase of animal products quality» Nitra. Czechoslovakia. - 1990. - P.25-27.

9. Pandian N. J. Guidelines for research and utilization of genetically modified fish / N. J. Pandian. // Cur. Sci. - 2001. - V.81. - № 9. - P.1172-1178.

10. Krasnov A. Changes in tissue Cellularity are associated with growth enhancement in genetically modified Arctic char (Salvelinus alpines L.) carrying recombinant growth hormone gene / A. Krasnov, J. J. Agren, T. J. Pitkanen, H. Molsa // Genet. Anal. Biomal. Eng. - 1999. - V.15. - P.99-105.

11. Volcan A. D. Growth hormone transgenesis affects osmoregulation and energy metabolism in zebrafish (Danio rerio) / A. D. Volcan, C. Martinez, M. Gaspar et al. // Transgenic Res. - 2013. - V.22. - Issue 1. - P.75-88.